PCR test

Maximilian Reindl studoval chemii a biochemii na LMU v Mnichově a od prosince 2020 je členem redakčního týmu Seznámí se s tématy lékařské, vědecké a zdravotní politiky, aby byla srozumitelná a srozumitelná.

Další příspěvky od Maximiliana Reindla Veškerý obsah je kontrolován lékařskými novináři.

Testy PCR se staly nepostradatelnou součástí moderní medicíny a molekulární diagnostiky. Protože jsou tak přesné, jsou považovány za „zlatý standard“. Lze je použít v celé řadě aplikací, od detekce patogenů až po screening dědičných chorob - tedy všude tam, kde je nutné spolehlivě detekovat i ty nejmenší stopy dědičného materiálu. Zde se dozvíte, proč je test PCR tak přesný, kde se používá a jak detailně funguje.

Co je test PCR?

Test PCR je laboratorní metoda z molekulární biologie a medicíny. Test se používá k přímé detekci - a charakterizaci - genetického materiálu. Metodu PCR odborníci považují za snadno proveditelnou, univerzálně použitelnou a robustní.

V laboratoři se test PCR skládá ze dvou kroků. V prvním kroku je stávající genetický materiál reprodukován pomocí polymerázové řetězové reakce nebo zkráceně PCR. Tímto způsobem lze zkoumat nejmenší stopy DNA. To je také důvod, proč jsou testy PCR tak citlivé.

Ve druhém kroku je genetický materiál separován, „tříděn“ a tím charakterizován podle svých vlastností. Je tedy určena jemná struktura DNA.

Existuje mnoho možných použití: Lékaři pomocí testu PCR zkoumají například nátěry na koronaviry, dárcovství krve na HIV nebo vyšetřují novorozence na případná dědičná onemocnění. Pomocí PCR lze také objasnit bakteriální infekce - například patogenem tuberkulózy - nebo parazitární infekce (malárie).

Pomáhají také v soudním lékařství usvědčovat pachatele na základě jejich genetického otisku prstu nebo se používají jako testy otcovství.

Všechny tyto aplikace jsou shrnuty pod termínem molekulární diagnostika. PCR tak nachází praktické uplatnění ve výzkumu, diagnostice a kriminalistice daleko za hranicí detekce patogenu Sars-CoV-2.

(Corona) Test PCR versus rychlý test PCR

Vyhodnocení testu PCR obvykle probíhá ve specializované laboratoři. To znamená, že materiál vzorku je odeslán a zkontrolován. Výsledek je obvykle obdržen o několik dní později.

Různé startupy (GNA Biosolutions, Spindiag) nedávno představily nové typy mobilních testovacích zařízení. Za to také obdrželi zvláštní povolení od Federálního institutu pro drogy a zdravotnická zařízení (BfArM). S pomocí těchto mobilních testovacích zařízení PCR by byl test PCR možný také bez specializované laboratoře.

Tento přístup má velký potenciál, protože spolehlivý výsledek testu by mohl být k dispozici během několika hodin přímo v místě, kde byl vzorek odebrán (testovací centrum).

Do jaké míry budou takové systémy rychlých testů PCR v praxi převládat, zatím nelze posoudit. Rovněž také není známo, jak rychle budou testovací centra dodávána s těmito zařízeními plošně.

V dohledné budoucnosti se proto budou i nadále provádět „pravidelné“ laboratorní testy PCR, které způsobují určité zpoždění mezi odběrem vzorků a výsledkem testu.

Jak spolehlivý je test PCR?

PCR je osvědčená detekční metoda v molekulární diagnostice a medicíně. Je považován za takzvaný zlatý standard s velmi nízkou chybovostí. Testy se vyznačují zejména velmi vysokou citlivostí a specificitou.

Citlivost znamená spolehlivost, s jakou test najde genetický materiál, který má být detekován.

Specifičností se rozumí jistota, s jakou test stanoví, že daný genetický materiál není ve vzorku přítomen.

Kdy testy PCR fungují v případě infekce Sars CoV-2?

Test PCR zpravidla detekuje koronovou infekci dva až tři dny před a až 20 dní po nástupu příznaků. I u infikovaných lidí, kteří zůstávají zcela bez příznaků, test funguje v kritickém časovém období, kdy mohou nakazit ostatní.

V jednotlivých případech je důkaz toho dokonce možný 60 dní po objevení příznaků onemocnění.

První den po koronové infekci může být test PCR také negativní, přestože je přítomna infekce. V takovém případě nebylo v době testu nátěru v krku dost virů. Pokud však existuje důvodné podezření na infekci, lékaři obvykle následující den provedou další test PCR.

možné zdroje chyb

Míra chyb v procesu kopírování DNA je v praxi zanedbatelná. Přestože DNA polymerázy nikdy nefungují správně, v procesu testu PCR téměř nehrají roli.

V praxi spočívají možné zdroje chyb v procesu odběru vzorků: Je proto důležité, aby nátěry prováděl vyškolený zdravotnický personál. Vzorky slin a kloktadla by mohly přesnost snížit, protože zde dochází k efektům ředění.

Jak funguje test PCR?

Test PCR provádí například rodinný lékař nebo ve speciálních testovacích centrech. Nejprve lékaři nebo vyškolení zdravotničtí pracovníci odeberou vzorek. Na test se obvykle odebere tampon z horních cest dýchacích. To má obvykle formu výtěru z úst nebo nosu a hrdla.

Možné je i kloktání oplachovým roztokem. Vzorek krve je pro detekci korony atypický - ale rozšířený například při screeningu novorozenců.

Bez ohledu na typ odebraného vzorku se genetický materiál nachází na vatovém tamponu, v oplachovém roztoku nebo v kapce krve. Tento materiál vzorku je odeslán do laboratoře, kde je izolován a purifikován.

Test PCR je pak rozdělen do dvou kroků:

• PCR: V tomto kroku se znásobí množství původního genetického materiálu.
• Elektroforéza: V druhém kroku jsou segmenty genomu „tříděny“ podle velikosti. Tímto způsobem lze charakterizovat vzorek - určuje se jemná struktura genetického materiálu.

Krok 1: PCR - „Polymerázová řetězová reakce“

„PCR“ je prvním ze dvou pracovních kroků: Zde se znásobí množství stávající počáteční DNA. Protože pouze tehdy, když je genetický materiál k dispozici v dostatečném množství, může být vyšetřen. Většinou se jedná o lidskou DNA; testy na koronavirus jsou podle toho virová RNA.

Zkratka PCR znamená anglický výraz „Polymerase Chain Reaction“.

Co je potřeba pro PCR?

Počáteční DNA je umístěna v reakční nádobě se speciálními látkami. Stávající genetický materiál slouží jako šablona, ​​která je kopírována za přítomnosti určitých enzymů (Taq polymerázy) a určitých základních stavebních bloků DNA.

Proces kopírování probíhá v několika - opakujících se - cyklech (cyklech).

Konkrétně se kombinují následující látky:

• Počáteční DNA: materiál vzorku, který má být replikován.
• Základní stavební kameny DNA: Jedná se o nukleobáze adenin, tymin, cytosin a guanin.
• DNA polymeráza: Enzym, který spojuje jednotlivé stavební bloky DNA a vytváří přesně definovaný řetězec DNA. Nově získaný pramen je zrcadlovým (komplementárním) obrazem původního výchozího materiálu.
• Roztok pufru: Polymerázová řetězová reakce probíhá ve fyziologickém roztoku pufru. To zajišťuje podmínky podobné těm, které se nacházejí v lidských buňkách. Tento roztok udržuje pH stabilní a také obsahuje ionty hořčíku. Tyto kontrolované podmínky jsou nezbytné k zajištění funkčnosti DNA polymerázy.
• Primery: Skládají se ze 16 až 24 párů bází a slouží jako výchozí pozice a startovní signál. Primery ukazují DNA polymerázu, v kterém bodě (výchozí DNA) začíná proces kopírování.

Jak probíhá test PCR?

Protože všechny látky potřebné pro PCR jsou nyní v reakční nádobě, může začít samotný proces kopírování genetického materiálu. Toto je pouze spuštěno, kontrolováno a opět zastaveno teplotou.

Reakční nádoba se následně cíleně zahřívá nebo chladí na různé teploty. To se provádí pomocí speciálního zařízení - takzvaného tepelného cyklovače. Celková reakce trvá přibližně jednu až dvě hodiny.

Jednotlivé kroky cyklu PCR jsou:

• Denaturace dvouvláken DNA: Vzorek se zahřeje na přibližně 90 stupňů Celsia. V důsledku toho se původní dvouvlákno DNA rozpadne na dvě oddělená (komplementární) jednotlivá vlákna.
• Připojení základního nátěru: Teplota se sníží na mírně pod 60 stupňů Celsia. Výsledkem je, že se primery (dopředné primery, reverzní primery) připojují k definovaným polohám na odpovídajících jednotlivých vláknech DNA.
• Rozšíření: Teplota se zvýší mírně nad 70 stupňů Celsia. DNA polymeráza nyní začíná pracovat v tomto teplotním optimu. Připojuje se k polohám primerů a krok za krokem rozšiřuje původní jedno vlákno DNA, dokud není k dispozici přesná (komplementární) kopie (syntéza DNA).

Po dokončení cyklu se teplota opět zvýší na přibližně 90 stupňů Celsia - cyklus začíná znovu.

Pomocí metody PCR lze sekvence DNA replikovat až na přibližně tři páry kilobází (kbp). To odpovídá přibližně 3 000 základním stavebním blokům DNA spojeným do „řetězce“. Pro srovnání: lidský genom uchovává plány a informace pro provoz buňky v přibližně třech miliardách párů bází - genom koronaviru se naopak skládá z 30 000 párů bází. Test PCR lze použít pouze k reprodukci a vyšetření krátkých úseků celkové DNA.

Zásadní jsou primery

Volba primerů je pro proces PCR zásadní. Například v diagnostice Sars-CoV-2 se používá několik primerů (multiplexní PCR).

Testy Corona PCR hledají tři různé virové geny: Celková specificita se zvyšuje téměř na 99,99%. To znamená, že s touto vysokou mírou úspěšnosti existuje pouze jeden falešně pozitivní test na 10 000 vyšetření (pokud je vzorek odebrán správně).

Kolik kopírovaného genetického materiálu je tam nyní?

Předpokládejme, že po prvním cyklu existují dvě identická dvojvlákna DNA.

Po každém cyklu se množství (zkopírovaného) genetického materiálu zdvojnásobí. Množství DNA tedy exponenciálně roste.

Jinými slovy: po druhém cyklu jsou čtyři identická dvojvlákna - po třetím cyklu osm dvojvláken - po čtvrtém cyklu 16 dvojvláken a po pátém cyklu již 32 dvojvláken.

Lékaři tento proces obvykle opakují asi dvacetkrát až třicetkrát.

Metaforicky řečeno to znamená: I když byl ve vzorku na začátku nalezen pouze jeden dvouvláknový DNA, po dvaceti cyklech už bude v reakční nádobě milion stejných kopií.

Co znamená hodnota Ct?

Počet dokončených cyklů PCR je uveden ve formě takzvané hodnoty Ct. „Ct“ je odvozeno z anglického výrazu „cycle threshold“. Tato hodnota Ct umožňuje učinit prohlášení o množství hledaného genetického materiálu.

Při nízké hodnotě Ct 20 je mnoho počátečního genetického materiálu. Pokud je však hodnota Ct vysoká - přibližně 30 cyklů - je odpovídajícím způsobem málo DNA. Cyklus PCR proto musí probíhat častěji.

Krok 2: Elektroforéza „Třídění podle velikosti“

Konečně, pokud existuje dostatek „obohaceného“ genetického materiálu, může dojít k tomu, co je známé jako elektroforéza. Vědci používají určitou vlastnost DNA: její elektrický náboj.

Jednotlivé stavební bloky DNA jsou navzájem spojeny (negativně) nabitým páteří cukr-fosfát. Čím delší je určitá sekvence DNA, tím vyšší je její elektrický náboj.

Pokud je genetický materiál umístěn do specifického nosného média (agarózy) a je aplikováno elektrické napětí, segmenty DNA se začnou pohybovat v důsledku svého náboje. Protože delší úsek DNA cestuje rychleji než kratší fragment, oddělují se podle velikosti.

Tímto způsobem lze genetický materiál zkoumat a charakterizovat. V praxi se neznámý vzorek se známou referencí obvykle aplikuje na „startovní čáru“ a po určité době se navzájem porovnává.

Pokud je „rychlost migrace“ pro obě sekvence stejná, znamená to: Detekce je velmi pravděpodobně pozitivní - hledaný gen je obsažen ve vzorku.

Zvláštní případ koronaviru: příprava vzorku a RT-PCR

Detekce patogenu pro koronavirus je speciální případ. Sars-CoV-2 je jedním z takzvaných RNA virů. To znamená, že genom Sars-CoV-2 je ve formě RNA (ribonukleové kyseliny).

RNA se od DNA liší jen několika způsoby. Mimo jiné je k dispozici jako jedno vlákno a je založen na cukrové ribóze místo 2 "deoxyribózy. Nukleobázový tymin byl také nahrazen uracilem jako čtvrtou bází.

Tuto virovou RNA je nutné před pravidelným testem PCR „přepsat“ do DNA. Tento proces se nazývá reverzní transkripce (RT) - odtud termín RT -PCR. V průběhu tohoto procesu se získá jedno vlákno cDNA („komplementární DNA“). V dalším kroku je jedno vlákno cDNA doplněno druhým, zrcadlově převráceným řetězcem DNA.

Na konci přípravy vzorku je dvouvlákno DNA, které odpovídá původnímu plánu RNA viru: Pouze toto dvouvlákno lze nyní použít jako templát v testu PCR.

Jak dlouho trvá, než se dostaví výsledek?

Po odeslání vzorku do laboratoře obvykle obdržíte výsledek po jednom nebo dvou pracovních dnech.V testovacích centrech, která často zkoumají vzorky na místě, to může trvat jen několik hodin. Časové období do značné míry závisí na příslušném testovacím centru a jeho logistice.

Navzdory složitým pracovním procesům jsou moderní laboratoře schopny provádět testy PCR s vysokou propustností. S implementací pomáhají speciální automatizovaná zařízení.

Test PCR je stále považován za poměrně „pomalou“, ale o to spolehlivější metodu detekce.

Co se stane, když je výsledek pozitivní?

Pokud je vzorek odebrán správně, pozitivní test PCR znamená, že testovaná osoba je velmi pravděpodobně infikována Sars-CoV-2.

Pokud vám bylo pomocí testu PCR potvrzeno, že jste nakaženi koronavirem, ministerstvo zdravotnictví obdrží od příslušné laboratoře zprávu o pozitivním výsledku testu. V takovém případě nařídí ministerstvo zdravotnictví izolaci nebo karanténu.

Jsem automaticky nakažlivý, pokud dostanu pozitivní test PCR?

Většinu času ano. Ale ne vždy. Výsledek testu PCR by měl být vždy interpretován v kontextu. Pozitivní test primárně znamená, že máte v sobě virový materiál.

Pokud jste nedávno trpěli Covidem 19 (několik dní), test PCR by mohl být stále pozitivní - i když jste již opět zdraví. Jedná se o speciální případ a nevýhodu vysoce citlivého testu, protože může také detekovat fragmenty viru, který se nemůže reprodukovat.

Někdy je užitečný doplňkový test protilátek

V takových případech poskytuje test protilátky jistotu, která zajišťuje platnost testu PCR. Nejlepší je to probrat se svým lékařem. Mohou vám pomoci správně interpretovat výsledek testu PCR.

Co dělat, když je výsledek negativní

Negativní výsledek testu PCR znamená s vysokou pravděpodobností, že jste při odběru vzorku nesestavili Covid-19, a proto v současné době nejsou nakažliví. Můžete však být v raných stádiích infekce.

Koronovou infekci lze obvykle zjistit až od druhého nebo třetího dne po infekci. Výsledkem tedy není lístek zdarma. Měli byste proto i nadále dodržovat vzdálenost a hygienická pravidla a nadále nosit masku FFP2 - pro sebe i pro ochranu ostatních.

PCR test u dětí

Pediatrický test PCR se neliší od testu PCR dospělých. Odběr vzorků i interpretace výsledků platí jak pro děti, tak pro dospělé.

Jaká jsou rizika testu PCR?

Test PCR nepředstavuje žádná fyzická rizika. Pouze odběr vzorků z nosohltanu je některými lidmi vnímán jako obtěžující nebo nepříjemný.

Kolik stojí test PCR?

Veškeré náklady vynaložené na test PCR budou pokryty, pokud váš ošetřující lékaři nebo zdravotní oddělení takový test schválí. Náhrada nákladů se obvykle zvažuje, pokud již máte své vlastní příznaky nebo jste měli přímý kontakt s infikovanými lidmi.

I v případě pozitivního rychlého nebo autotestu máte nárok na bezplatný test PCR.

Poznámka: Pokud jste se doma testovali a obdrželi jste pozitivní výsledek, měli byste se okamžitě telefonicky domluvit se svým rodinným lékařem. Váš ošetřující lékař s vámi telefonicky prodiskutuje další postup.

Alternativně je nejlepší volat 116 117 a zaregistrovat se na test PCR. Až do potvrzovacího testu byste v ideálním případě měli zůstat doma, abyste chránili sebe i ostatní.

Tagy:  zdraví žen terapie digitální zdraví